Obtenció de suspensió hidrosoluble

​

En un primer moment, es prova d’obtenir la suspensió hidrosoluble de fosfolípids segons la guia de fabricació proporcionada pels col·laboradors experts de GP Pharm. Un cop comprovat que el procediment és fàcil d’aplicar i seguir al laboratori, es procedeix a encapsular substàncies actives dins els liposomes.

​

Així doncs, es duen a terme varies proves amb els fosfolípids abans d’encapsular els extractes d’algues i vegetals. Es segueixen les fórmules patró indicades a continuació, obtenint-se els següents resultats (Taula 1): 

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

Taula 1. Composició extracte hidrosoluble de liposomes

​

 

Primerament es prova d'encapsular urea, una substància en estat sòlid i altament soluble en aigua. S'afegeixen 2 g d’urea pura a la solució. S’obté una mescla heterogènia de color groguenc, mostrant separació de fases en estat de repòs, característica del producte i ja vist a GP Pharm (Figura 1).

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

Figura 1. Separació de fases en solució hidrosoluble

​

​

Atenent a la impossibilitat d’obtenir 2 g d’extracte sec de proteïnes d’algues, es decideix provar introduir proteïnes en dissolució aquosa emprant tris-EDTA 1x. Es realitza una solució d’albúmina 10mg/ml i després es dilueix a 1/10. Per a fabricar la solució, es pesen 0,1 g d’albúmina bovina en un vidre de rellotge, emprant una balança analítica. Amb l’ajut d’un paper de filtre es traspassa en un tub de fons rodó de 10 ml i es mescla en 10 ml de la solució de TE. A continuació, es du a terme una dilució 1/10, on es posa 1 ml de la solució 0,01g/10 ml en un altre tub amb 9 ml de TE. S’obté així una solució d’albúmina 0,01g/ml o 1mg/ml. Novament s’obté una solució característica d’aquest tipus de producte (veure figura 2).

La solució es guarda en un envàs de vidre en refrigeració i s’observa en un microscopi utilitzant l’ocular 20x, tenyint la mostra amb una gota de blau tripà o metilè. S’observa la presència d’estructures similars als liposomes multivesiculars (MVV) i/o multilaminars (MLV) [1][2] (Figures 2 i 3).

 

 

​

 

​
 

                                   Figura 2. MVV/MLV amb extracte aquós (font pròpia)                        Figura 3 MVV/MLV amb extracte aquós (font pròpia) 

​

​

Rere provar varis cops de formar els liposomes amb l'albúmina i un cop optimitzada la fórmula patró del producte a fabricar (sèrum), es procedeix a introduir les proteïnes d'algues a la solució aquosa.

​

​

Encapsulament de proteïnes

​

Transcorreguts uns dies i per a comprovar si s’ha encapsulat l’albúmina dins els liposomes, es centrifuga 1 ml de mostra durant 4 minuts a 4000 rpm a la microcentrífuga i es recupera el sobrenedant. Aquest sobrenedant, s’analitza posteriorment mitjançant el mètode de Bradford, per espectrofotometria de llum visible a una longitud d’ona de 590 nm.

​

Es fa el mateix amb la mostra de proteïnes d’algues en dissolució ja introduïdes dins els liposomes. Sabent que en 2 ml de solució hi ha aproximadament 0,405 mg de proteïna d'algues (0,203 mg/ml) i s'introdueixen en 57,5 g de producte → 0,007 mg/g. Tenint en compte que la densitat del producte és de 1,15 g/ml (1150 mg/ml), la concentració d'algues és de 0,008 mg/ml.

​

Els resultats de la recta patró obtinguts són els següents (Taula 2):

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

Taula 2. Resultats recta patró 

​

S'analitza 1 ml d’extracte d’algues de Dunaliella salina (0,008 mg/ml de proteïna) i 1 ml d’albúmina bovina (1mg/ml), obtenint unes absorbàncies a 590 nm de 0,192 i 0.313 respectivament.

​

Es representen els resultats de les absorbàncies obtingudes vers les concentracions de proteïna utilitzades (mg/ml). També es representen els valors en escala logarítmica, descartant els punts on ja es perd la linealitat (Taula 3).

 

​

​

​

​

​

​

​​

​

​

Sabent que inicialment tenim 0,008 mg/ml de proteïna, podríem afirmar que els liposomes encapsulen una gran part d'aquestes. No obstant, la concentració d'albúmina es troba a 0,02 mg/ml. i s'obté un resultat de concentració superior. Això pot ser degut a una mala prepraració de la mostra d'alúmina (mesura de 1 ml de solució 10 mg/ml) amb una pipeta graduada, havent-hi pipetes aforades i micropipeta p1000 o a un mal enrasament inicial. També pot ser degut a una errada en la pesada o mesura de l'absorbància (les cubetes de plàstic són difícils de netejar i sempre queda un mínim de residu blavós del reactiu usat en el mètode de Bradford, podent interferir en la mesura i els resultats de l'equació de la recta).