EXTRACTES VEGETALS - resultats i discussió
RESULTATS CULTIU D'ALGUES
Creixement de cultius
S'inicien els cultius a una concentració d'alga Dunaliella salina del 3,3% (v/v) d'algues i unes concentracions de sal (NaCl) 100 g/L, 120 g/L i 150 g/L. Degut a la baixa concentració d'inòcul i a la poca quantitat de nutrients (Goldmedium 0,2 M en nitrats 1x), en un principi s'observa un llarg període de latència (aproximadament 5 dies).
Taula 1. Resultats de densitat òptica (D.O.) dels cultius d'algues inicials
Gràfica 1. Resultats de densitat òptica (D.O.) dels cultius d'algues inicials
Es manté el volum constant de cultiu al llarg de les setmanes mitjançant l'addició de més medi (aigua de mar filtrada i Goldmedium 0,2 M (1x)). Al cap d'un mes, s'observa que el cultiu que creix lleugerament millor és el de 120 g/L de NaCl. (Gràfica 1).
Es procedeix a escalar aquest cultiu a un matràs (reactor) de 2 L, incrementant la concentració de nutrients del medi a 2x. En aquest moment es recol·lecta el cultiu de 150 g/L i el cultiu mare de la IEPAAC per a començar amb les extraccions de proteïna.
El cultiu de 120 g/L es monitoritza durant 70 dies (Gràfica 2). Durant les primeres dues setmanes s'aprecia un creixement considerable tant de la D.O. com del nº de cèl·lules. A la tercera setmana (dia 22) s'aprecia una lleugera disminució del número de cèl·lules del cultiu, indicant que el cultiu està en fase estacionàra. En aquest moment, es recol·lecta una part del cultiu per a extreure'n les proteïnes i s'afegeix més medi per tal de mantenir el volum de cultiu inicial (cultiu en drawfill). A la novena setmana (dia 57) sembla que el nombre de cèl·lules viable també ha disminuït (tot i que la densitat òptica segueix creixent) (Taula 2), de manera que al cap d'uns dies es recol·lecta el cultiu altre cop. S'observa el següent creixement:
Taula 2. Resultats de densitat òptica (D.O.) del cultiu d'algues 120 g/L NaCl
Gràfica 2. Resultats de densitat òptica (D.O.) del cultiu d'algues 120 g/L NaCl
El punt màxim de D.O. mesurada a una absorbància de 600nm s'assoleix al cap de 63 dies amb un valor de 0,546. El creixement màxim en quant al compteig del nombre de cèl·lules s'observa al cap de 14 dies amb un creixement de 5,5^6 cèl/ml. Això suggereix que en un principi, s'observa una mínima correlació entre amdós mètodes de creixement. veient-se el primer pic (assoliment de la fase estacionària) al cap d'unes 3 setmanes. Durant la resta de cultiu, els valors obtinguts del comptatge cel·lular és molt inferior, suggerint errors en el comptatge i/o obtenció de mostres poc representatives a l'hora de mostrejar el cultiu.
Si ens fiem de les dades de la primera part del cultiu, fins a assolir el seu màxim de creixement (5,5^6 cèl/ml), podem obtenir dades de la seva velocitat de creixement:
Suposant que no hi ha fase de latència i que el punt de creixement màxim del cultiu es troba al cap de 13 dies (t=13), s'obté que la velocitat de creixement és de 0,09 dies^-1 (Taula 3).
Taula 3. Paràmetres de creixement
Si suposem que el creixement exponencial correspon del dia 8 al dia 14, s'obté una velocitat de creixement de 0,12 dies^-1 (Taula 4).
Taula 4. Paràmetres de creixement
Per assegurar-nos d'aquestes dades, caldria haver fet el cultiu per triplicat, o com a mínim fer el comptatge amb 3 alíquotes diferents cada vegada, així com també per la D.O [1][2]. A més a més, donat que les algues es dupliquen en pocs dies, caldria realitzar un monitoreig diari per adjustar millor totes les dades obtingudes.
També és important considerar l'experiència del personal que realitza el comptatge, doncs és molt important realitzar un correcte entrenament i seguir sempre la mateixa metodologia.
S'observen també temps de latència diferents entre els cultius inicials i el cultiu a 120 g/L de NaCl. Cal considerar que totes les condicions s'han mantingut pràcticament iguals (temperatura, llum, pH), però s'ha duplicat la quantitat de nutrients disponibles, afectant a la velocitat de creixement el cultiu [3].
Extracció i quantificació proteica
Es realitzen 3 extraccions:
- Extracció 1. Cultiu d'algues a 150 g/L de NaCl + cultiu mare inicial (setmana 4) - s'obtenen les mostres 1 i 2
- Extracció 2. Cultiu d'algues recol·lectat del primer creixement a 120 g/L NaCl (setmana 3) - s'obtenen les mostres 3 i 4
- Extracció 3. Cultiu d'algues recol·lectat del segon creixement a 120 g/L NaCl (setmana 10) - s'obtenen les mostres 5 i 6.
Les mostres es recol·lecten seguint el protocol descrit a materials i mètodes. Les extraccions 1 i 3 es realitzen emprant sonicació i la 2 sense.
Es parteix d'una recta patró 10mg/ml d'albúmina bovina i es fan dilucions seriades mitjançant el mètode de Bradford. Els resultats obtinguts de les extraccions són els següents:
Extracció 1 (mostres 1 i 2)
Es descarten els valors d'absorbància de 5 mg/ml, 2,5 mg/ml i 1,25 mg/ml per a tal d'aconseguir una millor linealitat (R2= 0.9898, resultant una R de 0,9949) (Taula 5). L'equació de la recta resultant és y= 0,3751x - 0,1351
Taula 5. Resultats recta patró mostres 1 i 2
A continuació, es mesura l'absorbància de les mostres 1 i 2, obtenint resultats de 0,634 i 0,649 respectivament. Es substitueixen els resultats a la recta, obtenint els resultats següents:
[ mostra 1 ] = (0,3751 · 0,634) - 0,1351 = 0,103 mg/ml
[ mostra 2 ] = (0,3751 · 0,649) - 0,1351 = 0,108 mg/ml
Les proteïnes es troben en un volum de 0,4 mg de tampó tris-EDTA (TE), de manera que s'obtenen uns pesos de proteïna de 0,041 mg (mostra 1), 0,043 mg (mostra 2).
La mitjana d'aquests és 0,042 mg i inicialment es disposa de 294,1 mg de pellet extret.
Rendiment (%) = (pes proteïna obtinguda / pes biomassa inicial) x 100 → (0,043 mg / 294,1 mg) x 100 = 0,0147 % ~ 0,015%
Extracció 2 (mostres 3 i 4)
Es descarten alguns valors d'absorbància per aconseguir una millor linealitat (R2= 0.9959, resultant una R de 0,9979)(Taula 6). L'equació de la recta resultant és y= 2,235x - 0,0129
Es mesura novament l'absorbància de les mostres 1 i 2, juntament amb les mostres 3 i 4, obtenint resultats d'absorbància a 590 nm de 0,104, 0,081, 0,067 i 0,095 respectivament
Taula 6. Resultats recta patró mostres 1, 2, 3, 4
Es substitueixen els resultats a la recta:
[ mostra 1 ] = (0,104 + 0,0129) / 2,235 = 0,052 mg/ml
[ mostra 2 ] = (0,081 + 0,0129 / 2,235 = 0,042 mg/ml
[ mostra 3 ] = (0,067 + 0,0129) / 2,235 = 0,036 mg/ml
[ mostra 4 ] = (0,095 + 0,0129) / 2,235 = 0,048 mg/ml
Per a mesurar les mostres a l'espectrofotòmetre es va fer una dilució 1/2, afegint 50 µl d'aigua destil·lada i 50 µl de les mostres problema. Els resultats obtinguts es multipliquen pel factor de dilució aplicat, resultant:
[ mostra 1 ] = (0,104 + 0,0129) / 2,235 = 0,105 mg/ml
[ mostra 2 ] = (0,081 + 0,0129 / 2,235 = 0,084 mg/ml
[ mostra 3 ] = (0,067 + 0,0129) / 2,235 = 0,072 mg/ml
[ mostra 4 ] = (0,095 + 0,0129) / 2,235 = 0,097 mg/ml
S'aprecia similitud entre les concentracions de les mostres 1 i 2 trobades mitjançant la primera recta patró i la segona, trobant-se valors d'entre 0,080 i 0,110 mg/ml de proteïna aproximadament.
Per altra banda, es pesa el tub de centrífuga d'on s'extreuen les mostres corresponents als eppendorfs 1 i 2, obtenint un pellet de 0,294 g. El pellet que s'obté del tub de les mostres 3 i 4 és de 0,229 g.
Les proteïnes es troben en un volum de 0,4 mg de tampó tris-EDTA (TE), de manera que s'obtenen uns pesos de proteïna de 0,042 mg (mostra 1), 0,034 mg (mostra 2), 0,0286 mg (mostra 3) i 0,0386 mg (mostra 4).
Fent la mitjana de les mostres 1-2 i de les mostres 3-4, i aplicant la fórmula del rendiment, s'obté que el rendiment de l'extracció 1 (amb sonicació) és lleugerament superior al de l'extracció 2 (sense sonicació). Els resultats obtinguts són 0,0128 % (~0,013 %) i 0,0147 % (0,015 %), respectivament.
Els resultats esperats eren al contrari, obtenint un millor rendiment de les mostres a les quals se'ls ha aplicat sonicació. S'observa però, que la quantificació de la mostra 1 mitjançant la primera recta patró (extracció 1 (1)) i la mostra 2 utilitzant la segona recta patró (extracció 2), mostren valors pràcticament iguals, sent la diferència bastant poc significativa amb la mostra 1 emprant la segona recta. (extracció 1 (2)) (Gràfica 3).
Gràfica 3. Comparativa quantificació de les diferents mostres
Caldria haver realitzat l'extracció de les mateixes mostres amb i sense sonicació per a poder comparar els mètodes. Es coneix que, habitualment, la sonicació és un mètode que ajuda a l'extracció de proteïnes i es decideix aplicar-lo a les mostres de la següent extracció.
Extracció 3 (mostres 5 i 6)
El nostre departament de qualitat analitza les mostres d'algues de la tercera extracció, trobant els següents resultats:
Taula 6. Resultats recta patró mostres 5 i 6
Es substitueixen els resultats a la recta:
[ mostra 5, rèplica 1 ] = (0,651 - 0,1603) / 18,277 = 0,027 mg/ml
[ mostra 5, rèplica 2] = (0,661 - 0,1603) / 18,277 = 0,027 mg/ml
[ mostra 6, rèplica 1 ] = (0,690 - 0,1603) / 18,277 = 0,029 mg/ml
[ mostra 6, rèplica 2] = (0,681 - 0,1603) / 18,277 = 0,028 mg/ml
Quan es realitza la preparació de la mostra es fa una dilució 1/10, obtenint uns valors mitjos de 0,271 mg/ml per la mostra 5 i de 0,287 mg/ml per la mostra 6.
Les proteïnes de la mostra 5 es troben en un volum de 0,57 mg de tampó tris-EDTA (TE) i la mostra 6 en un volum de 0,640 mg, de manera que s'obtenen uns pesos de proteïna de 0,153 mg (mostra 5) i 0,183 mg (mostra 6).
En aquest cas no es pesa el pellet de proteïna obtingut rere la centrifugació i no es disposa de dades del seu rendiment.
Els extractes obtinguts es guarden en congelació i finalment es recol·lecten per a inserir-se dins els liposomes. La quantitat total de proteïnes recol·lectades al final de tot el procés és de 0,405 mg en un volum total de 2 ml (1,77 g).
- Mostra 1: 0,080 ml x 0,105 mg/ml → 0,008 mg
- Mostra 2: 0,270 ml x 0,084 mg/ml → 0,023 mg
- Mostra 3: 0,210 ml x 0,072 mg/ml → 0,015 mg
- Mostra 4: 0,230 ml x 0,097 mg/ml → 0,022 mg
- Mostra 5: 0,565 ml x 0,271 mg/ml → 0,153 mg
- Mostra 6: 0,640 ml x 0,287 mg/ml → 0,184 mg
Per tant, es pot considerar que per cada mil·lilitre de solució hi ha 0,203 mg de proteïna.
Es descarten alguns valors d'absorbància per aconseguir una millor linealitat (R2= 0.9911, resultant una R de 0,9955). L'equació de la recta resultant és y= 18,277x + 0,1603
Es mesura l'absorbància de les mostres 5 i 6 per duplicat. Els resultats són:
Mostra 5, rèplica 1 = 0,651
Mostra 5, rèplica 2 = 0,661
Mostra 6, rèplica 1 = 0,690
Mostra 6, rèplica 2 = 0,681
Separació de proteïnes
Es realitzen 2 gels electroforètics de poliacrilamida (SDS-PAGE). Al primer es mostren les mostres 1, 2, 3 i 4, mentre que al segon s'hi troben les mostres 5 i 6.
Figura 1. Marcador de pes molecular, mostres 1 ,2, 3, 4
Figura 2. Marcador de pes molecular, mostres 6 i 5
El primer gel (Figura 1) no ha corregut massa bé i s'aprecien els pesos moleculars amb molt poca intensitat.
Mesurant amb un regle, es veu que el front electroforètic es troba a 3,1 cm (31 mm). Sembla que no s'aprecien diferències de proteïnes entre les diferents mostres. En totes elles s'hi veuen les següents bandes:
100 kDa a 4 mm
70 kDa a 6,5 mm
50 kDa a 10 mm
40 kDa a 12 mm
30 kDa a 16 mm
20 kDa a 22 mm
15 kDa a 28 mm
10 kDa a 31 mm
Respecte al segon gel (Figura 2) es veuen molt millor les bandes. No s'ha mesurat la distància del front electroforètic, però comparant-lo amb el marcador de pes molecular s'aprecien les següents bandes:
250 kDa, 150 kDa, 100 kDa, 70 kDa, 50 kDa, 30 kDa, 20 kDa i 10 kDa,
Les algues contenen doncs un ampli ventall de proteïnes diferents i molt variables en quant al seu pes molecular. Seria interessant repetir el primer gel de les mostres 1, 2, 3 i 4 per a veure si realment les bandes són similars.
RESULTATS EXTRACCIÓ SOXHLET
Algunes de les substàncies actives de les flors d'àrnica i calèndula es poden extreuen en forma d'hidrolat. Els hidrolats solubilitzen les substàncies hidrosolubles de les parts vegetals de les plantes tals com fenols, betacarotens, tanins, cumarines i flavonoides. També s'extreuen pigments com els antocians i substàncies odoríferes en algunes espècies [4][5].
Sovint, l'extracció de compostos hidrosolubles ve acompanyada d'alcohols com l'etanol o el metanol (solució hidroalcohòlica), permetent en part l'extracció de compostos liposolubles com la helenalina, una lactona sesquiterpènica present a la planta de l'àrnica [6][7][8].
Inicialment, es plantejava l'ús de rotavapor, molt efectiu per extreure compostos liposolubles [7], però aquest no es pot utilitzar actualment ja que en manquen algunes peces.
Existeixen molts mètodes convencionals d’extracció amb dissolvents, com Soxhlet, maceració en fred i premsat. Tots ells són procediments amb èxit per a l’extracció de compostos actius però presenten sovint problemes de degradació per calor, baixos rendiments i presència d’impureses a les mostres finals. Per aquest motiu, s'ha investigat àmpliament mètodes d’extracció alternatius i innovadors dins la indústria farmacèutica, com l’extracció per ultrasons i per fluids supercrítics [9].
La maceració en fred és el mètode d’extracció més convencional i consisteix en submergir el material vegetal dins el dissolvent a temperatura i pressió ambient. Tot i no presentar degradació dels compostos actius per calor, té alguns desavantatges, com els llargs temps d’extracció i un baix rendiment. L’extracció mitjançant Soxhlet, tot i ser més eficient en quant a rendiment, utilitza un sistema de reflux i alta temperatura per a obtenir l’extracte, no essent recomanable per a productes sensibles al calor [10].
Els ultrasons són utilitzats habitualment per l’extracció de productes naturals sensibles a la temperatura, i utilitzen l’energia de les ones ultrasòniques per a crear cavitació a la superfície del material, accelerant així la dissolució d’aquest al dissolvent i la conseqüent extracció dels biocomponents [9][10].
L’ús del CO2 supercrític és una tecnologia prometedora en contraposició a altres mètodes d’extracció. Aquest CO2 presenta una major capacitat de difusió, menor viscositat i tensió superficial que els dissolvents convencionals, fent que la transferència de massa sigui més eficient i respectuosa amb el medi ambient [7][9].
En aquest cas, per tal d'extreure el màxim de compostos possibles, tant hidro com liposolubles, es planteja l'ús d'una solució hidroalcohòlica (50:50 aigua-etanol). Es posen 10g d'àrnica en un vas de precipitats amb 100g de solució. Es fa el mateix per la calèndula i ambdos vasos es posen dins un bany d'ultrasons. Es deixa enfuncionament 1 hora i mitja a 35 ºC i després es filtra amb l'ajut d'un embut i paper de filtre. Es deixa una setmana en un cristal·litzador per a tal que evapori la solució. S'obté una fina capa d'extracte que queda fortament enganxada al cristal·litzador. La quantitat extreta sembla ínfima i es descarta com a mètode extractor viable per a incorporar a les formes farmacèutiques.
Figura 1. Extracció amb solució hidroalcohòlica assistida per ultrasons
Figura 2. Extractes hidroalcohòlics obtinguts
Finalment, amb els recursos i temps disponibles, s'opta per l'ús del Soxhlet amb aigua com a solvent, sent un mètode eficaç, ràpid i que no requereix de cap tractament posterior, podent-se usar directament com a part de la fase aquosa de qualsevol producte farmacèutic o cosmètic.
Fonts bibliogràfiques
[1] Álvarez FJ. Producción de compuestos bioactivos a partir de biomasa algal basada en la biofiltración y la biorrefinería. Universidad de Málaga. 2017
[2] Mayorga C, Manso L. Crecimiento de la microalga Dunaliella salina en un cultivador Raceway en condiciones de laboratorio. Centro de Producción e Investigaciones Agroindustriales – Universidad Tecnológica de Panamá. 2017
[3] Fiambres D. Crecimiento y biomasa de Dunaliella sp. cultivada en medios limitantes en nitrógeno. BIOtecnia, vol. xii, nº3. 2010
[4] Domínguez LE. EFECTO DE LA APLICACIÓN DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE FLORES DE CALÉNDULA (Calendula officinalis) EN LA ESTABILIZACIÓN DEL COLOR Y VIDA ÚTIL EN PULPA DE FRUTAS. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá. 2012
[5] Martínez-Flórez S. Los flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutrición Hospitalaria. León. 2002
[6] Carretero ME, Ortega T. Flores de Arnica montana: interés terapéutico. Panorama actual del medicamento, ISSN 0210-1394, Vol. 40, Nº. 395, 2016, págs. 737-741.
[7] Pequeño Alonso, Álvaro. Optimization of processing conditions on the quality of extracts and formulation of Arnica montana. Faculty of Chemistry and Chemical Engineering, University of Maribor; 2022.
[8] [23] Pérez OIS. Evaluación de la cinética de extracción del aceite esencial de Calendula officinalis L. mediante hidrodestilación y calentamiento óhmico asistido por hidrodestilación. 2016;
[9] Arciniegas J, García A, Naranjo L, Morales A, Escobar J, Sarmiento M. Fundación Universitaria Agraria de Colombia – UNIAGRARIA–.
[10] Rojas-Bedoya. Extracción de metabolitos a partir de Calendula officinalis y evaluación de su capacidad colorante y antibacterial. Rev. colomb. biotecnol [online]. 2020, vol.22, n.1, pp.60-69. ISSN 0123-3475.