top of page

PROCÉS D'EXTRACCIÓ DE PROTEÏNES

fonsverd.PNG

Extracció de proteïnes de Dunaliella salina

L'extracció de Dunaliella salina es du a terme quan s'assoleix la fase estacionaria del cultiu. Es monitoritza el creixement per comptatge cel·lular i quan pràcticament no hi ha creixement o la població d'algues comença a disminuir, es recol·lecten les cèl·lules per centrifugació.

Materials utilitzats

- Vasos de precipitats

- Bany d’ultrasons (Bandelin Sonorex Digiplus)

- Centrífuga (Hettich EBA 20)

- Tubs de centrífuga

- Microcentrífuga (Hettich MIKRO 120)

- Eppendorf

- Pipetes Pasteur 2 ml

- Micropipeta (Pipeta monocanal Handrop digital p1000)

- Puntes de micropipeta

- Tampó de lisi (NaCl 150 mM, Tris-Hydroxymethyl 50 mM, Tween 20 al 2%)

- Tampó d’EDTA 1x (TE)

- Acetona

- Cultiu d’algues de Dunaliella salina

- Bany amb gel i aigua

- Gradeta tubs centrífuga

- Gradeta eppendorf

Protocol d'extracció d'algues

Obtenció d'extracte per centrifugació

​

  1. Centrifugar un volum determinat de cultiu d'algues en 2 tubs de centrífuga de 15 ml.

  2. Afegir 10 ml i centrifugar durant 10 minuts a 6000 rpm.

  3. Descartar el sobrenadant en un vas de precipitats.

  4. Repetir els passos anteriors afegint 10 ml cada cop als mateixos tubs fins a centrifugar tot el volum de cultiu.

  5. Congelar els tubs de centrífuga amb els extractes obtinguts (*)

  6. Resuspendre pellet amb 500 µl de buffer de lisi. Si el pellet és molt gran i els 500 µl de buffer de lisi no són suficients per a separar el contingut del tub de centrífuga, afegir-hi també aigua de mar filtrada i traspassar les cèl·lules a diversos eppendorf amb l'ajuda d'una micropipeta p1000.

  7. Centrifugar els eppendorfs en una microcentrífuga a 14000 rpm durant 10 minuts.

  8. Descartar el sobrenedant.

  9. Homogeneïtzar i resuspendre el pellet afegint 400 µl de buffer de lisi fred.

  10. Congelar els eppendorf amb els extractes obtinguts (*)

​

Trencament de membrana plasmàtica per sonicació i congelació

​

  1. Sonicar en bany d’ultrasons durant 20 segons (**).

  2. Ràpidament posar en aigua i gel 20 segons.

  3. Repetir els dos punts anteriors 2 vegades més.

  4. Congelar 20 minuts.

  5. Descongelar a temperatura ambient fins que la mostra es torni fluida.

  6. Centrifugar a 14000 rpm durant 10 minuts.

  7. Recuperar el sobrenedant a un eppendorf net prèviament retolat. Descartar el pellet.

​

Precipitació de proteïnes amb acetona

​

  1. Afegir 4 volums d’acetona freda.

  2. Congelar 15 minuts.

  3. Descongelar a temperatura ambient fins que la mostra es torni fluida.

  4. Centrifugar a 14000 rpm durant 20 minuts.

  5. Descartar el sobrenedant.

  6. Deixar evaporar l’acetona uns 2 minuts.

  7. Resuspendre en 400 ul de buffer d’EDTA (TE) 1x.

​

(*) El procés d'extracció amb centrífugues de laboratori és llarg, el qual requereix de varis dies i de congelacions intermedies per a conservar les mostres. Caldrà descongelar les mostres a temperatura ambient abans de prosseguir almb el procés d'extracció.

(**) La sonicació s'utilitza de forma opcional en alguna de les mostres. Veure els resultats obtinguts a resultats i discussió

bottom of page