Cultiu

​

S'utilitza l’alga Dunaliella salina, procedent de l’Institut d’Estudis Professionals Aqüícoles i Ambientals de Catalunya (IEPAAC), ubicat a Sant Carles de la Ràpita. La seva propagació es du a terme en un matràs Erlenmeyer per a cultius cel·lulars d'1 L i un cop ajustades les condicions de salinitat s'escala a un matràs de 2 L.

​

​

Condicions

​

Per l’escalat al laboratori, s'utilitzen diferents concentracions de sal per a veure quines són les condicions salines més adients pel seu creixement. Atenent a la salinitat i nutrients necessaris pel seu creixement [1][2][3], inicialment es cultiva la D. salina amb diferents concentracions de sal (100 g/L (1,7 M), 120 g/L (2 M), 150 g/L (2,6 M)) i amb una solució Goldmedium a 0,2 M en nitrats.

​

Els diferents cultius s'inicien en 3 matrassos d’1 L, inoculant 10 ml d’un cultiu mare del IEPAAC en 300 ml d’aigua de mar filtrada (filtre de 0,65 µm) amb Golmedium en proporció 1:10. Els cultius es mantenen constantment en agitació emprant un compressor amb aire filtrat a 0,22 µm a temperatura no controlada (20 ºC ± 3) i amb un fotoperíode 12:12. Durant aproximadament un mes, un parell de cops a la setmana es mesura la seva densitat òptica (DO) per així controlar quin dels cultius presenta major creixement. També es monotoritza el pH mitjançant una sonda mòbil, obtenint valors entre 6,8 i 7,8.

​

​

Mesura del creixement

​

El creixement del cultiu es monitoritza mitjançant dos paràmetres diferents [4][5]:

• Densitat òptica (D.O.) - mitjançant un espectrofotòmetre de llum visible a uns valors d'absorbància de 600 nm. S’utilitza com a blanc aigua destil·lada i les mesures es realitzen amb mostra del cultiu sense diluir en cubetes de plàstic.

• Comptatge cel·lular - mitjançant un hemocitòmetre (càmera de Neubauer) en un microscopi invertit a 10x de manera setmanal. S’afegeixen 20 µl de mostra que penetren per capilaritat. Donat que la Dunaliella salina és una microalga mòbil, cal diluir les mostres prèviament amb lugol al 1% en proporció 1:10 (9 parts de lugol per 1 de mostra), per a fixar-les a la preparació i poder procedir amb el seu comptatge. La càmera es coloca al microscopi i es procedeix a comptar a 10x tots els quadrants per a saber el número de cèl·lules presents en cada ml de cultiu. Per calcular el nombre de cèl·lules s'utilitza la següent equació:

​

nº cèl·lules / ml   = (total cèl·lules / nº quadrants) x 10^4 x factor de dilució

​​​

El creixement d’un cultiu de microalgues s’expressa com l’increment de biomassa, ja sigui mitjançant el comptatge del nombre de cèl·lules o segons els canvis en la densitat òptica.

​

​

Extracció

​

L'extracció de proteïnes es du a terme a través de diferents processos quan s'assoleix la fase estacionaria del cultiu. El creixement cel·lular en un cultiu ocórre en quatre fases [4][6]:

• Fase de latència: les cèl·lules s'estan ajustant a les condicions del cultiu i no es divideixen.

• Fase exponencial o de creixement logarítmic (log): les cèl·lules  es divideixen activament i és la millor etapa per avaluar el creixement de la població. Al final d'aquesta fase és el millor moment per a realitzar traspassos cel·lulars o subcultius.

• Fase estacionaria: el creixement del cultiu es va relentitzant a mida que les cèl·lules van acumulant residus cel·lulars (metabolits secundaris) i s'esgoten els nutrients.

• Fase de mort o descens: la població de cèl·lules vives disminueix a mida que la població va morint.

​

Es monitoritza el creixement per comptatge cel·lular i quan pràcticament no hi ha creixement i pràcticament la població d'algues comença a disminuir (fase estacionaria), es recol·lecten les cèl·lules. Els processos duts a terme són els següents:

​

• Obtenció d'extractes per centrifugació​

• Trencament de membrana plasmàtica per sonicació i congelació

• Precipitació de proteïnes amb acetona

​

​

​​

 

 

Processos de separació i quantificació de proteïnes

​

Les proteïnes solubles es poden determinar pel mètode de Bradford. Aquest consisteix en l’elaboració d’una recta patró amb albúmina bovina (10 mg/ml) i la posterior lectura a 590 nm mitjançant un espectrofotòmetre [7].

La separació de les diferents proteïnes i pèptids per pes molecular es realitza mitjançant una electroforesi en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) [8].

​

​

​